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在现代临床医学研究中,常常需要将全血中单核白细胞(淋巴细胞、大单核细胞)与红细胞和多形核白细胞分离。在临床治疗应用中常常需要将全血作成分分离(全血分离成血浆,血小板,白细胞,红细胞等等)
(一)血细胞的实验室纯化:
血液中存在着各种不同类型的血细胞,每种类型细胞有不同的特点和功能。医学研究常常需要较纯的单一品种的血细胞。用离心法分离和纯化是非常有效的手段,但如何使血细胞的密度梯度分离简单而且实用,很多科学家和试剂生产厂作了大量的研究和筛选。在这方面Bφyum(文献1)做了开拓性的研究,他使用挪威Nycomed pharma,A/S公司生产的梯度材料Lymphoprep 和由瑞典Pharmacia-Biosystems AB 公司提供的Ficoll Paque,用简单的低速阶梯梯度离心纯化了单核白细胞获得成功。此后(文献2),用非电离性梯度材料Na-metrigoate 和Nycodenz(可消除多糖成分)纯化血细胞效果更好。
典型的离心分离实验:
1. 人血单核细胞的纯化:
Ⅰ 加有抗凝剂的全血样品,通常加0.32%柠檬酸钠较为普遍;
Ⅱ 用等量的等渗盐液稀释全血
Ⅲ 在10-15ml离心管下部注入3ml Na-metrizoate-Ficoll分离液
Ⅳ 在分离液上部小心地铺盖6ml已经稀释的全血
Ⅴ 低速离心机,水平转头,单管容量10-15ml,600xg,20分钟,20℃,慢加速,慢减速。(不要用4-5℃,否则效果很差)
Ⅵ 离心后,单核细胞和少量血小板悬浮在血液样品和分离液的中向夹层,小心地用吸管吸出
Ⅶ 在单核细胞中加几毫升生理盐水以降低其密度
Ⅷ 用同样的离心机250xg,5分钟,20℃?#27927;?#25968;次,可以得到更纯的单核细胞沉淀
Ⅸ 制备的细胞可重悬浮在生理盐水或同源血浆中待用
2. 单核血细胞和多形核血细胞的单次离心分离法:
Ⅰ 刚抽出的新鲜人血,加抗凝剂后,取3-5ml铺在10ml离心管底部
Ⅱ 血样上部铺等量的Polymorphoprep(Nycomed Pharma A/S公司产物)
(注意:选择较细长透明塑料(笔颁或笔贰罢)离心管或玻璃离心管,液柱总高在6-10尘尘左右)
Ⅲ 离心:低速或高速冷冻离心机水平转头450g?5分钟,20℃
Ⅳ 离心后细胞分布:以10cm液柱为例,底部1.2-1.4cm为红细胞,往上3cm为分离液,再往上0.4cm为中性白细胞带(多形核白细胞),再往上0.6-0.8cm为分离液,在这层分离液和最上层血浆之间夹有一层约0.4cm液柱高的单核细胞
Ⅴ 如果离心时间过长,或温度过高,多形核白细胞(主要是中性白细胞)也会变成沉淀
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