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离心机向土壤顿狈础进军

      1.称取样品土样5g,加入灭菌的石英砂，不要液氮研磨，这样子对DNA伤害很大，几乎全部片段化了。可以在这步加上PBS洗涤下土壤，一是能够去除些杂质，二是能够使得土壤处于悬浮状态，然后可以在涡旋仪上剧烈涡旋2－3min，使得土壤颗粒破碎。然后用土壤离心机12000rpm离心5min，弃上清。

      2.加入13.5mL的DNA提取Buffer，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm摇2h；

      3.加入700微升20%SDS，65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次；

      4.6000rpm室温离心15min,收集中间液相层；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65℃水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次；这里可以考虑再增加抽提一次。或者用5mL而不是3mL。最后实在装不下了可以分在两个50mL离心管里面离心。

      5.向收集的液相层中加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层；在做抽提的时候加用一步酚氯仿，原因是酚能够更好的使蛋白变性。如果不考虑用酚的话，建议用氯仿异戊醇抽提两次。会发现颜色会变清不少。

      6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，室温放置1－2h；

      7.沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec，移液枪析出残留液体；

      8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。沉淀贴壁很紧，不要用小枪头吹吸搅动，可以将沉淀浸没后放置于4度过夜或数小时，沉淀就会蓬松。

   土样比较特殊，黑色，腐殖质等物质含量高，这个必须纯化，样品里面太多的多糖类物质和腐殖质,选择qiagen的40KB的胶回收试剂盒，嫌太贵的话可以考虑电洗脱。

   DNA提取液组成：100mM Tris，100mMEDTA，200mMNaCl，2%PVPP，3%CTAB，pH9.0
  
   以上为三次提取的详细过程及试剂用量。

注意事项，所有的枪尖，包括1尘尝的都要去尖后灭菌。每个步骤动作都要轻柔，这样顿狈础才会完整。