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离心机用于质粒顿狈础的提取

时间：2015年12月22日信息来源：湘智离心机字体：大中小【打印此页】

    实验介绍
    质粒DNA是存在于细菌染色体外的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA分子。基因克隆实验中常将质粒作为携带目的基因的载体。目前从细菌中提取质粒DNA多采用碱裂解法,该法操作简便，实验时间短的优点。现将具体实验操作介绍如下：
    实验中使用的主要仪器：

用于质粒顿狈础的提取的离心机     离心机     电泳设备
    凝胶成像系统
    1 实验前准备
    用酒精棉球对实验操作台进行擦拭即可.
    2 菌体收集
    用1.5mlEP管对过夜培养的大肠杆菌进行菌体收集，收集两次约2.5ml过夜培养的菌液（有时根据菌液浓度适当调整）；取过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000 rpm离心1 分钟，后倒掉上清，进行第二次收集，重复第一次实验操作；
    3 菌体重悬
    向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μl 溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用200ul移液枪彻底悬浮细菌沉淀。注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
    4 菌体裂解
    向离心管中加入250 μl 溶液P2，及时温和地上下翻转3-4次使菌体充分裂解，要及时，是防止局部裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA 片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 分钟，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
    5 中和反应
    向离心管中加入350 μl 溶液P3（主要是些NacooH，中和溶液2中的碱），立即温和地上下翻转3-4 次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
    6 柱子平衡
    拿出吸附柱和收集管，将吸附柱套入入收集管中，向吸附柱CP3 中加入500μl 的平衡液BL，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）
    7 离心去除沉淀
    将第五步骤中和反应后的溶液，用12,000 rpm (~13,400×g )离心15 分钟去除菌体裂解后的残留蛋白和基因组DNA，时其在离心管底部形成沉淀，质粒分布于上清液。
    8 质粒过柱纯化
    将上一步收集的上清液转移到吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要转移出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g)离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。
    9 漂洗
    向吸附柱CP3 中加入600 μl 漂洗液PW（检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。（一般漂洗两次）。
    10 空甩
    一般在漂洗后要进行一次的空甩，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，具体是12,000 rpm (~13,400×g) 空甩离心2 分钟，后置于室温放置数分钟。
    11 洗脱DNA
    取干净的离心管，将吸附柱CP3 置于干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μl事先温浴的洗脱缓冲液，室温放置2 分钟，12,000 rpm (~13,400×g) 离心1 分钟将质粒溶液收集到离心管中。
    12 琼脂糖电泳检测提取质粒质量
    事先配制好1%浓度的琼脂糖电泳凝胶。取3ul上步骤提取的质粒，点样，200V电压电泳15min，后于成像系统观察。

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